DNA i historikernas tjänst

De två amatörhistorikerna Gelij Riabov och Aleksander Avdonin visste vad de hade hittat. Men det var bara en DNA-analys som kunde bekräfta att skelettresterna verkligen tillhörde Rysslands siste tsar, hans fru och tre av hans fem barn. Forskarna jämförde arvsmassa från de söndertrasade benbitarna med blodprover från nu levande släktingar till tsarfamiljen, bland andra drottning Elizabeth II:s make – prins Philip. Proverna stämde exakt överens och decennier av spekulationer kring vad som egentligen hände familjen Romanovs mest prominenta medlemmar fick ett slut.

Att analysera den arvsmassa som allt levande innehåller i form av deoxiribonukleinsyra eller DNA, blir ett allt viktigare verktyg, inte bara för biomedicinska forskare utan även för historiker, arkeologer, antropologer och paleontologer. Utseendet på den genetiska koden har visat sig kunna bidra med ovärderlig information och kan till exempel berätta om släktskap, både mellan enskilda människor och folkgrupper eller arter. Arvsmassan kan också avslöja forntida sjukdomar, folkvandringar eller hur livet på jorden utvecklades.

I dag ingår DNA-analyser även som en naturlig del av många faderskapsutredningar och kriminaltekniska undersökningar. Nästan osynliga mängder blod, urin eller saliv är allt som behövs för att knyta en misstänkt till brottsplatsen – för att inte tala om vilken information ett hårstrå eller en bit hud kan ge.

Till för bara några år sedan trodde man att arvsmassan bröts ner och försvann bara kort efter det att växten, djuret eller människan hade dött. I dag tycks det inte finnas någon gräns för hur gammal arvsmassan kan vara. Listan på fynd där forskarna har hittat flera tusen år gammalt DNA kan göras lång. Man har till och med lyckats isolera DNA-rester från flera miljoner år gamla insekter inneslutna i bärnsten, en bedrift som för tankarna till Steven Spielbergs biosuccé Jurassic Park.

Den första rapporten om att man lyckats identifiera gammalt DNA kom 1984. Amerikanen Russ Higuchi och hans kolleger vid Berkeleyuniversitetet i Kalifornien, USA, hade lyckats isolera och klona DNA från en kvagga, ett sebraliknande djur som levde på den afrikanska savannen men som utrotades 1878. Forskarna hade utgått ifrån en 140 år gammal päls. Anledningen var en pågående kontrovers forskare emellan huruvida kvaggans närmaste släkting var sebran eller hästen. De amerikanska forskarna lyckades identifiera mindre DNA-rester från kvaggan, och när man jämförde med motsvarande DNA-sekvenser hos dagens sebror och hästar, kunde man visa att det utdöda djuret var närmare släkt med sebror än med hästar.

Resultatet fick stor internationell uppmärksamhet, kanske inte så mycket för vad själva analysen gav vid handen, utan mer för att man över huvud taget hade lyckats ”återuppväcka” delar av ett sedan länge försvunnet genetiskt budskap, något som de allra flesta forskare vid den tiden ansåg vara helt omöjligt. Bara timmar efter det att djuret, växten eller människan dör, börjar arvsmassan, som finns lagrad inuti varje levande cell, att brytas ned. De kemiska bindningar som håller samman den spiralformade DNA-tråden försvagas. Tråden går sönder och den genetiska informationen börjar suddas ut.

Men bara några månader efter det att resultaten om kvaggan publicerades, kom nästa sensation. Ungefär samtidigt med de amerikanska forskarna hade en svensk doktorand vid Uppsala universitet fått en liknande idé. I dag är Svante Pääbo professor vid Max-Planck-institutet i Leipzig i Tyskland och en av de ledande auktoriteterna inom området, men då, i början av 1980-talet, studerade han immunologi. Kvällar och helger ägnade han dock åt sitt stora intresse för arkeologi. Hans idé var inte att återuppliva DNA från utdöda djur, utan från över 2 000 år gamla egyptiska mumier.

Via sitt universitet fick Svante Pääbo kontakt med ett museum i dåvarande Öst-Berlin och han lyckades komma över små vävnadsprover från 23 olika mumier. De flesta av proverna var så förstörda att de inte gick att använda. Men ett par höll måttet, vilket visade sig räcka för att uppsalastudenten skulle lyckas isolera genetisk information från människor som levde för mellan 2 310 och 2 550 år sedan.

När resultaten publicerades 1985 i tidskriften Nature stod det klart att försöket med kvaggapälsen inte bara var ett lyckokast som inte gick att upprepa. Inte nog med att det var möjligt att hitta och identifiera gammalt DNA, det kunde till och med bevaras i flera tusen år.

Men Svante Pääbos och Russ Higuchis och hans kollegers arbete hade inte varit lätt. För att lyckas hade de blivit tvungna att först isolera och sedan ”klistra” in de ytterst få DNA-bitar de hade kommit över i bakterier som sedan fick föröka sig så att den aktuella DNA-sekvensen skulle kopieras till tillräckligt stora mängder för att den skulle gå att analysera – en minst sagt omständlig procedur.

Detta förändrades emellertid i ett enda slag i slutet av 1980-talet när amerikanen Kary B Mullis utvecklade den så kallade PCR-tekniken (se specialartikel), en metod som med hjälp av speciella enzymer och värmeväxlingar gör det möjligt att snabbt kopiera försvinnande små DNA-mängder till betydligt större och mer lätthanterliga volymer. Veckor av tålamodsprövande arbete utfördes helt plötsligt på ett par timmar, dessutom med säkrare slutresultat. Tekniken innebar något av en revolution, inte bara för den molekylär-arkeologiska forskningen utan naturligtvis även för den medicinska.

Men finurliga tekniker till trots – den främsta fienden är och förblir tiden. Svante Pääbo hade visserligen bevisat att DNA kan bevaras i över två tusen år, men de bitar han lyckades rena fram var knappast någon fullständig arvsmassa. DNA-sekvenserna var inte längre än några hundra så kallade baspar, vilket ska jämföras med människans kompletta arvsmassa som rymmer uppemot tre miljarder baspar.

Därför försöker forskarna ofta isolera det DNA som finns lagrat i cellernas mitokondrier, snarare än det som finns i cellkärnan.

Inuti den levande cellen finns DNA normalt bara på två olika ställen, dels inne i cellkärnan, där merparten återfinns, och dels inuti mitokondrierna, som är små membranomslutna strukturer som finns överallt utanför cellkärnan och vars främsta uppgift är att producera energi.

Den stora fördelen med att titta på mitokondrie-DNA är att det inte bryts ner lika lätt och således oftast är mer välbevarat än den arvsmassa som finns i cellkärnan. En annan poäng är att det bara ärvs från modern, till skillnad från cellkärnans DNA som kommer både från mannens spermie och kvinnans ägg. Eftersom könscellerna bara innehåller hälften så många kromosomer som andra celler, innebär det att arvsmassan ”blandas ut” och förändras lite för varje generation som går. Det behövs inte många generationer för att arvsmassan ska se ganska annorlunda ut.

Mitokondrie-DNA däremot ärvs helt intakt i rakt nedstigande led på mödernet. Även spermier innehåller mitokondrier men de förtvinar och försvinner i samband med befruktningen. Kvar blir bara de som finns i kvinnans ägg. Alla kvinnor och män bär alltså på DNA-sekvenser som har sett mer eller mindre exakt likadana ut generation efter generation, vilket ger forskarna en unik möjlighet om man vill studera och jämföra arvsmassa från två organismer där det förflutit många generationer emellan.

Några av de mest omskrivna ”molekylär-arkeologiska fynden” har följaktligen också gjorts tack vare detta ”moder-DNA”. Ett exempel är just identifieringen av den sista tsarfamiljen.

Tsar Nikolaj II, av familjen Romanov, abdikerade i samband med februarirevolutionen 1917 (som enligt vår tideräkning ägde rum i mars). Sommaren 1918, under det efterföljande inbördeskriget, hölls han och hans familj fången i Ipatiev-huset vid Jekaterinburg i centrala Ryssland. Men vad som sedan hände med tsaren, hans fru, tsarinnan Alexandra, deras fyra döttrar – Olga, Tatjana, Maria och Anastasia – och deras ende son Alexej vet man inte med säkerhet. De uppgifter som funnits tillgängliga bygger nästan uteslutande på den information som den vitryske monarkistinspektören Nikolaj Sokolov samlade in under 1918 och 1919 och som resulterade i en dossier i sju volymer. Men hans uppgifter har aldrig blivit bekräftade och de olika versioner och rykten som cirkulerat kring familjen Romanovs öde har varit många.

Enligt Nikolaj Sokolovs berättelse samlades tsarfamiljen strax efter midnatt den 16 juli 1918 ihop av retirerande bolsjeviker. Familjen föstes samman i husets källare tillsammans med tre tjänare och familjens doktor, Eugene Botkin. Där sköts de på order av Lenin. Gevärsskotten lyckades dock inte döda alla, varför många av offren höggs ihjäl istället. Kropparna kläddes av och kastades upp på ett lastbilsflak. Tanken var att slänga ner dem i ett närliggande gruvschakt, men lastbilen gick sönder. Istället grävde man snabbt en grav och efter det att kropparna var på plats kördes lastbilen, som nu hade kommit igång igen, fram och tillbaka över gravplatsen för att utplåna alla spår.

Den grav som Gelij Riabov och Aleksander Avdonin hittade med hjälp av gamla kartor och fotografier i juli 1991 var mindre än en meter djup. Alla skelett bar spår av kraftigt våld. Märken efter vad som kunde antas vara gevärskulor och bajonetter fanns överallt, särskilt i skallarna, vars ansikten var helt förstörda. Några av tänderna hade lagningar av guld och platina, vilket tydde på ett aristokratiskt ursprung. Så långt tycktes Nikolaj Sokolovs berättelse stämma.

Men de ryska myndigheterna blev inte övertygade och inledde en officiell undersökning. Dess rättsmedicinska experter trodde sig kunna identifiera nio lik, varav tre barn. Om det verkligen var den sista tsarfamiljen man hade hittat, saknades alltså två kroppar. Men detta stärkte snarare misstankarna, eftersom en del historiska data tyder på att två av kropparna antingen brändes eller begravdes vid sidan om eller att, som många envisa rykten gjort gällande, två av tsarfamiljens medlemmar överlevde den blodiga massakern. Men trots detta gick det inte att med säkerhet säga om man verkligen hade hittat tsarfamiljen eller inte.

Ett år senare, 1992, tillfrågades därför ryska och brittiska forskare om att försöka säkerställa skelettresternas identitet med hjälp av DNA-analys.

Forskarna började med att preparera arvsmassan från respektive skelett genom att mala små benbitar från lårbenen. Genom att analysera de delar av DNA som tillhör könskromosomerna kunde forskarna visa att av de vuxna skeletten var fem av manskön och ett kom från en kvinna. De tre barnskeletten var alla av kvinnokön. Om skelettresterna tillhörde tsarfamiljen saknades alltså den ende sonen Alexej och en av döttrarna.

För att vara helt säkra på offrens identitet bestämde sig forskarna för att jämföra mitokondrie-DNA. I så fall gällde det alltså inte bara att hitta nu levande släktingar till tsar Nikolaj II och tsarinnan Alexandra, de var dessutom tvungna att vara släktingar på respektive moders sida.

Tsarinnan Alexandra var barnbarn till Victoria (1819–1901), drottning av Storbritannien och Irland. Drottning Victoria fick sammanlagt nio barn. Hennes andra dotter, Alice, gifte sig med storhertigen Ludvig av Hessen, i nuvarande Tyskland. Paret fick bland annat två döttrar; den blivande tsarinnan Alexandra Fjodorovna och prinsessan Victoria av Hessen. Denna Victoria födde sedermera en dotter, Alice av Battenberg, som i sin tur blev mor till Philip. Han tog senare sin mors efternamn, men angliserade det till Mountbatten, och ingick så småningom äktenskap med Storbritanniens nuvarande drottning, Elizabeth II. Prins Philip, hertig av Edinburgh, tillfrågades av forskarna och han ställde upp och lämnade lite blod.

För att ta reda på om tsaren fanns i massgraven eller inte togs blodprover från två släktingar. Dels från en dotterdotters dotterson till tsarens mormor – Louise av Hessen-Kassel (ett kurfurstendöme i nuvarande Tyskland), gift med Kristian IX av Danmark – och dels från ett barnbarns barn (alla kvinnor) till Nikolaj II:s syster.

Att påvisa om de tre barnen var släkt med varandra och med någon eller några av de vuxna i graven skulle bli relativt enkelt genom att matcha deras DNA-analys inbördes och med provsvaren från de vuxna skeletten och de från blodproverna från deras eventuella släktingar.

Proverna från de tre barnskeletten, den vuxna kvinnan och prins Philip stämde perfekt. Likaså stämde provsvaren från de två levande släktingarna till tsaren överens med ett av de fem vuxna mansskeletten. Däremot fanns tydliga skillnader mellan blodproverna och de övriga fyra mansskeletten.

Forskarnas slutsats blev att fem av de nio skelett som fanns i graven med allra största sannolikhet härrörde från den sista tsarfamiljen. Även om forskarna räknade pessimistiskt var sannolikheten att de inte skulle komma från tsarfamiljen 700 mot 1.

Samma år som Gelij Riabov och Aleksander Avdonin hittade tsarfamiljens massgrav, 1991, gjordes ett annat arkeologiskt vida mer intressant fynd. Ett par på vandring i de italienska alperna hade nästan snubblat på ett mycket välbevarat manslik vid kanten av en glaciär som visade sig vara 5 000 år gammalt.

Undersökningen av den så kallade Ismannens arvsmassa, som leddes av Svante Pääbo, visade att mannen tillhörde ett nordeuropeiskt stenåldersfolk. Man lyckades även isolera DNA från mannens kläder. Till exempel kunde man se att den halm som utgjorde den mantel han bar på och som fyllde hans skor, var mycket lik de grässorter som finns i dag och som alltså troligen odlades redan för 5 000 år sedan.

Men Svante Pääbos kanske mest häpnadsväckande fynd hittills presenterades i juli 1997. Han och hans kolleger hade lyckats rena fram mitokondrie-DNA från en neandertalmänniska. Fyndet rörde om i en stundtals mycket infekterad kontrovers, eftersom forskarna när de jämförde neandertalmänniskans DNA-sekvens med motsvarande ordningsföljd hos dagens människor kunde se att skillnaden var alldeles för stor för att neandertalmänniskan någonsin skulle kunna ha bidragit med något DNA till oss människor. Neandertalmänniskan tillhör alltså inte våra förfäder, utan utgjorde troligen en separat utvecklingslinje.

När forskarna jämförde sekvensen och andra kända släktskapsförhållanden såg de dessutom att den gren på släktträdet som skilde neandertalmänniskan och vår egen utvecklingslinje åt var mycket äldre än vad man dittills hade trott. Troligen började de två grenarna att separera redan för över 550 000 år sedan och inte för mellan 250 000 och 300 000 år sedan som fossilen hade antytt.

Kunskapen om DNA är naturligtvis också högintressant för de utvecklingsbiologer som lägger ett gigantiskt pussel över hur livet en gång tog sin början och hur dess släktträd har förgrenat och utvecklat sig till dags dato. Bland de utdöda djur som forskarna hittills har lyckats hitta meningsfulla DNA-sekvenser ifrån kan nämnas mammut, den sabeltandade tigern, de jättelika moafåglarna på Nya Zeeland, pungvargen och de flera meter höga sengångare som en gång vandrade på de amerikanska kontinenterna.

Och det tycks inte finnas någon gräns för hur långt tillbaka i tiden forskarna kan gå för att hitta rester av ett sedan länge försvunnet genetiskt budskap. År 1992 lyckades Raul Cano och hans forskargrupp vid Polytechnic State University i USA att analysera DNA från ett mellan 20 och 40 miljoner år gammalt bi som hade haft oturen att fastna i kåda som så småningom blev en bit bärnsten. Två år senare rapporterade samma forskare att de hade lyckats rena fram arvsmassa från en annan bärnstensinsekt som var hela 120 miljoner år gammal, vilket i dag är det äldsta kända DNA som någon lyckats identifiera.

Även om det finns forskare som tvivlar på hur tillförlitliga resultaten är från de allra äldsta fynden, är alla överens om betydelsen av de kunskaper som följer i DNA-analysernas kölvatten och vad de kommer att innebära i framtiden. Om ett par år räknar forskarna med att hela människans arvsmassa kommer att vara avläst i och med att det så kallade Hugo-projektet slutförs och i takt med att förståelsen om vår egen arvsmassa ökar, kan vi lära mer om hur livet gestaltade sig före vår tid.

Publicerad i Populär Historia 4/2000

Fakta: Mysteriet Mengele

I februari 1979 drunknade en äldre man i södra Brasilien. Han begravdes som österrikaren Wolfgang Gerhard på den lilla kyrkogården Senhora do Rosario i närheten av Embu. Men snart florerade rykten om att den döde var ingen mindre än den ökände Josef Mengele – Auschwitz dödsängel.

Den tyske läkaren Josef Mengele var vid sin död en av 1900-talets mest efterspanade krigsförbrytare. Han föddes 1911, blev medlem av nazistpartiet 1937 för att året därpå gå med i SS. Från 1940 tillhörde han Waffen-SS läkargrupp och 1943 kom han till utrotningslägret Auschwitz där han, förutom att leda selektionen av judar och andra fångar till gaskamrarna, utförde en rad sadistiska experiment under en medicinsk täckmantel. Inte minst barn, dvärgar och tvillingar drabbades av de smärtsamma ”undersökningarna” som inte sällan ledde till döden.

År 1945 kom Josef Mengele till lägret Mauthausen. Men när de allierade tågade in i maj samma år försvann han spårlöst. En tid senare dök han upp i Sydamerika, dit han troligen lyckats fly via Italien. År 1949 begärde och fick Josef Mengele politisk asyl i Argentina. Men när Tyskland tio år senare begärde att han skulle utlämnas flydde Mengele återigen, först till Paraguay och sedan vidare till Brasilien. Där slutade spåren.

Ryktena om den man som drunknade flera decennier senare ville inte ge med sig. De lokala myndigheterna protesterade, men 1985 grävdes graven upp och ett internationellt team av rättsmedicinska experter undersökte de ruttnade kvarlevorna. Allting tydde på att den döde verkligen var Josef Mengele. Men den israeliska arméns patolog tvivlade. Han pekade på en rad motstridiga vittnesuppgifter runt mannens verkliga identitet samt några frakturer på skelettdelarna, som inte stämde överens med Mengeles kända medicinska historia. Tre år senare föreslog Israel en DNA-analys. Ett litet prov från en av skelettdelarna jämfördes med DNA från Josef Mengeles son. De stämde exakt överens.

Kort därefter deklarerade Tyskland och Israel att fallet Mengele var avslutat. Jakten på dödsängeln från Auschwitz var över.

Fakta: PCR – Polymerase Chain Reaction

Den metod som har revolutionerat möjligheterna att studera gammalt DNA och även många områden inom den medicinska forskningen kallas Polymerase Chain Reaction, eller PCR. Tekniken kan liknas vid en kopieringsmaskin och gör det möjligt att från en väldigt liten mängd DNA få så många kopior att det blir möjligt att starta en analys. Idén är lika enkel som genial och renderade dess upphovsman, amerikanen Kary B Mullis, nobelpriset i kemi 1993.

Arvsmassan, DNA, kan liknas vid en stege som vridits på längden till en spiral. ”Stegpinnarna” består av två molekyler, eller nukleotider, som bildar ett baspar. Fyra olika nukleotider – adenin, tymin, guanin och cytosin, som vanligtvis förkortas A, T, G och C – kan ingå i paret. Men A binder alltid till T och G kan bara bilda ett par med C, och vice versa.

När forskarna lyckades isolera lite arvsmassa, från exempelvis ett utdött djur, värms lösningen till 94 grader Celsius. Värmen får DNA-biten att smälta isär på längden till två ”steghalvor”. Sedan kyler man lösningen något och tillsätter en mycket kort DNA-bit, primer, som binder till ena steghalvan. Blandningen värms igen och när man tillsätter ett speciellt enzym och lösa nukleotider sätter kopieringen fart. Enzymet binder till primern och börjar vandra längs DNA-biten. Om den stöter på ett A, sätter enzymet dit ett T, och om den ”känner av” ett G sätter den fast ett C, och så vidare tills DNA-stegen återigen är komplett. Efter kopieringen innehåller lösningen dubbelt så många kompletta DNA-spiraler som den gjorde från början.

När syntesen är klar värms blandningen igen och processen upprepas. Kopieringen sker alltså i cykler och eftersom de nyss gjorda kopiorna används som underlag till nya kopior i nästa cykel fördubblas antalet DNA-bitar i varje cykel. Mängden ökar alltså exponentiellt och snart finns ett mycket stort antal DNA-kopior i lösningen.

Publicerad i Populär Historia 4/2000